蔡教授微生物診斷真有趣

一、主動篩檢含KPC的革蘭氏陰性菌菌株

  (一)KPC的定義：

     Carbapenemase為首先發現於Klebsiella pneumoniae分離株的一種酵素，因此而有其名。

• 然而，其它細菌包括Serratia及Salmonella enterica亦可產生此酵素。
• 產生此酵素將導致對所有對penicillins, cephalosporins (即cefepime, ceftriaxone), carbapenems (即meropenem, ertapenem)及aztreonam呈抗藥性。

  (二)主動篩檢含KPC的革蘭氏陰性桿菌菌株的規劃步驟

0. 1.先了解含KPC的革蘭氏陰性菌株在醫院內的流行病學以決定是否主動篩檢
0. 2.決定檢體類別以及是否直接接種或使用運送培養基：

–    若將採取運送培養基收檢，因為carbapenems (ertapenem，meropenem，imipenem，doripenem)在液體中不穩定，故使用一般配方的運送培養基。運送培養基送至檢驗室後再接種增菌培養基。

–    若將採取檢體直接接種方式而不用運送培養基，則選用增菌培養基如MacConkey broth (5 mL)，加入檢體後馬上加入一個10μg的meropenem，imipenem，或doripenem紙錠(因此將含有2μg/mL的藥物)，混合均勻。

0. 3.在35℃過夜培養後，若肉湯培養基呈混濁，則以四區劃線法劃種含添加物的CHROMagar KPC。注意劃線的技術。
0. 4.在35℃培養18~24小時，將疑似菌落進行初步鑑定，若確認後，則大量保存在GermBank管中，貯存在－70℃冷凍櫃。
0. 5.當收集到適當數目的疑似含KPC革蘭氏陰性桿菌菌落後，再操作整批菌種的最後鑑定及篩檢藥敏試驗[改良賀治試驗(modified Hodge test)，確定其對該抗生素的抗藥性。

確認KPC的三種試驗方法比較

二、主動篩檢含CTX-M的革蘭氏陰性菌抗藥菌株

   (一)CTX-M beta-lactamase class A的定義：

• 此命名係因為其對cefotaxime比對其它ceftazidime, ceftriaxone或cefepime具有較大的活性，tazolebactem比clavulanate能抑制CTX-M beta-lactamase
• 並非因為突變，係因為獲得Kluyvera species染色體中含beta-lactamase基因的plasmid
• 與TEM或SHV beta-lactamase的相近性僅40%
• 在Salmonella typhimurium及已知至少有80個以上CTX-M酵素，亦發現於腸內菌的其它菌種及及Serratia marcescens)
• 在南非及東歐以CTX-M-14、CTX-M-3及CTX-M-2分布最廣，目前，的CTX-M-15在英國最流行

   (二)主動篩檢含CTX-M的菌株的規劃步驟

0. 1.先了解含CTX-M的革蘭氏陰性菌株在醫院內的流行病學以決定是否主動篩檢
0. 2.決定檢體類別以及是否直接接種或使用運送培養基：

–    若將採取運送培養基收檢，則請IVD-GMP廠家製作添加4μg/mL cefotaxime之運送培養基；送至檢驗室後再接種增菌培養基。運送培養基。運送培養基送至檢驗室後再接種增菌培養基。

–    若將採取檢體直接接種方式而不用運送培養基，則選用增菌培養基如MacConkey broth (7.5 mL)，加入檢體後馬上加入一個30μg cefotaxime之紙錠(因此將含有4μg/mL的藥物)，混合均勻。

0. 3.在35℃過夜培養後，若肉湯培養基呈混濁，則以四區劃線法劃種含添加物的CHROMagar CTX。注意劃線的技術。
0. 4.在35℃培養18~24小時，將疑似菌落進行初步鑑定，若確認後，則大量保存在GermBank管中，貯存在－70℃冷凍櫃。
0. 5.當收集到適當數目的疑似含CTX-M革蘭氏陰性桿菌菌落後，再操作整批菌種的最後鑑定及篩檢藥敏試驗[進行稀釋試驗測定MIC)，確定其對該抗生素的抗藥性。 

  三、主動篩檢含NDM-1 β-lactamase腸內菌之規劃步驟

0. 1.先了解含NDM-1的革蘭氏陰性菌株在醫院內的流行病學以決定是否主動篩檢
0. 2.決定檢體類別以及是否直接接種或使用運送培養基：

–    若將採取運送培養基收檢，因為carbapenems (ertapenem，meropenem，imipenem，doripenem) 在液體中不穩定，故使用一般配方的運送培養基。運送培養基送至檢驗室後再接種增菌培養基。

–    若將採取檢體直接接種方式而不用運送培養基，則選用增菌培養基如MacConkey broth (5 mL)，加入檢體後馬上加入一個10μg 的meropenem，imipenem，或 doripenem 紙錠(因此將含有2μg/mL的藥物)，混合均勻。

0. 3.在35℃過夜培養後，若肉湯培養基呈混濁，則以四區劃線法劃種含有2μg/mL的藥物添加物EMB或MacConkey agar (先將20 mL培養基配在20×150 mm螺蓋試管，接種當天在100℃煮溶後，冷至50℃加入4個10μg的meropenem，imipenem，或doripenem紙錠，混合均勻，冷卻，凝固，再接種檢體)。注意劃線的技術。
0. 4.在35℃培養18~24小時，將疑似的生長菌落進行初步鑑定，若確認後，則大量保存在GermBank管中，貯存在－70℃冷凍櫃。
0. 5.當收集到適當數目的疑似含NDM-1革蘭氏陰性桿菌菌落後，再操作整批菌種的最後鑑定及篩檢藥敏試驗[改良賀治試驗(modified Hodge test)
0. 6.同時操作對tigecycline及colistin的藥敏試驗(紙錠方法呈感受性，以及操作稀釋試驗測定MIC)，確定其對該抗生素的抗藥性
0. 7.最後以PCR方法確認carbapenem resistance gene blaNDM-1
0. 8.分離株在以pulsed-field gel electrophoresis進行XbaI-restricted genomic DNA
0. 9.其plasmids再利用S1 nuclease digestion及PCR typing

NDM-1陽性腸內菌分離株的藥敏型式：

  對Tigecycline呈56~67％感受性，而對Colistin呈89~100％感受性。

蔡教授建議：

• 實驗室若進行主動篩檢抗藥性菌株枝調查或研究，建議篩檢檢體約500個(臨床350個，環境150個)才具有代表性。
• 若能夠分離100個抗藥性菌株進行各項試驗，將更能顯示該菌株的流行病學特性。
• 可根據研究調查結果規劃健康照護相關感染(HCAI)控制措施。
• 將研究成果寫成專文發表在專業雜誌上，經驗分享。